来源：ACS Publications

基因编码的荧光蛋白 （FPs） 是可视化生物过程和分子传感的重要工具，极大地促进了我们对生命系统结构和功能特性的理解。新型 FP 的开发实现了突破性的成像和检测技术。最近的进展包括 multicolored、光活化 和抗光漂白的 FP，促进多通道成像/检测、超分辨率成像和长期成像。然而，已报道的 FP 的荧光寿命仍然局限于纳秒 （ns） 范围，FP 的超长荧光寿命代表了该领域尚未开发的前沿领域。

开发具有毫秒级发光寿命的基因编码磷光蛋白 （PP） 将为生物检测、诊断和成像应用提供引人注目的优势。这些蛋白质的延长寿命使其能够在背景荧光和其他荧光信号的衰减期之后持续发光。这一独特的特性为光信号创造了一个正交的检测通道，并促进了时间分辨检测 （TRD），从而显著提高了信噪比和检测灵敏度。然而，开发具有长荧光寿命的 PP 面临着相当大的技术挑战。如上所述，即使在定向进化之后，FP 的荧光寿命仍然被限制在纳秒范围内。通过定向进化从 FP 获取 PP 似乎效率低下。化学标记可以将长寿命探针引入蛋白质中，但这种方法面临标记选择性和背景干扰问题。在长寿命荧光复合物中，镧系金属异常狭窄的发射带和较长的荧光寿命等特点引起了我们的注意。此外，研究表明，强吸收性有机配体可以通过分子内能量转移使镧系金属敏化。这种敏化策略保持了镧系元素配合物的长发光寿命，同时显著提高了它们的发射强度，从而能够开发各种长寿命的镧系元素探针。受这种机制的启发，这种敏化方法可以用于设计基因编码的磷光蛋白。

我们建议将镧系元素螯合和敏化过程整合到单个蛋白质中以设计磷光蛋白。具体来说，我们的方法利用肽标签或蛋白质（包括 LBT和 LanM） 进行镧系元素螯合，同时掺入靠近镧系元素中心的光敏非天然氨基酸 （UAA） 以构建磷光蛋白。在这种设计中，由于没有敏化剂结合，溶液中的游离镧系元素离子表现出弱磷光，因为光敏剂 （UAA） 本身不能螯合镧系元素金属。游离 UAA（敏化剂）的荧光寿命短，因此可以通过时间分辨测量排除其信号。因此，长寿命磷光完全来自同时掺入 UAA 和螯合镧系金属的蛋白质，而不是来自游离镧系金属或游离 UAA。通过这种方式，这种设计确保磷光信号仅来自基因标记的分子，从而实现免洗涤检测。

在此，我们设计了一种基因编码的磷光蛋白并进行定向进化以增强其磷光亮度。磷光蛋白是通过将荧光非天然氨基酸作为天线基团掺入?LanM?蛋白中而产生的，LanM 蛋白以皮摩尔范围内的高亲和力螯合镧系元素。通过系统筛选 UAA 掺入位点，我们确定了能量转移的最佳位置，与野生型 （WT） LanM 蛋白相比，掺入非天然氨基酸使镧系元素磷光增加了约 10 倍。随后的定向进化导致新的 LanM 变体显示磷光信号强度额外增强了 5 倍。然后，我们利用化学进化来改变非自然天线的化学结构，导致磷光信号进一步提高 10 倍。

这种设计和进化过程导致了基因编码的磷光蛋白的开发，具有高亮度和高达 500 μs 的寿命，能够对镧系元素进行选择性分析。此外，我们开发了基于这种进化变体的铕传感器、蛋白酶传感系统和免疫荧光成像，表明磷光蛋白可以成为开发具有显着检测灵敏度和特异性的基因编码传感器的新平台通过时间分辨测量。